天然药物化学 · 第一章总论

第一章总论 · 复习总览

娄红祥 / 张教真 · 山东大学药学院

本章涵盖：天然药物化学的研究内容与发展史、天然化合物的生物合成、提取分离方法、结构研究法（光谱学）四大板块。

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第一节绪论

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第二节生物合成

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第三节提取分离

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第四节结构研究法

★重点难点框架

🟢 掌握（核心，必考）

天然药物常用的提取、分离方法
各类分离材料的特点及其分离化合物的基本原理和影响因素

🟡 熟悉

天然药物化学的研究范围和课程学习重点
天然化合物生物合成的构建单元和主要构建反应
各类化合物的生物合成途径

⚪ 了解

天然药物化学的发展简史及其最新研究进展（如质谱成像、冷冻电镜）

i使用说明

左侧导航可在四节之间切换；点击带 ▶ 的标题可展开/收起详细内容；"速记卡片"用于快速记忆关键概念（点击翻面）；"自测题"提供选择题自测并即时反馈。

第一节　绪论

研究内容 · 发展简史 · 与新药发现的关系 · 新药创新实例

1一、天然药物化学的研究内容

定义：天然药物化学是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科。关键词：天然药物化学

研究流程（举例：金银花 → 绿原酸）

天然药物 → 提取 → 分离 → 结构鉴定 → 活性筛选，是从原料到明确化学结构活性成分的完整流程。

（三）天然药物的来源（四大类）

🌿 植物：如苔藓、鼠尾草等

🐛 动物：如美洲大蠊、天龙等

🪨 矿物：如石膏等

🦠 微生物：如青霉菌、放线菌等

（四）正确理解天然药物有效成分

有效成分：天然药物中具有一定生物活性、能代表天然药物临床疗效的化合物
生物活性成分：经过药效试验或生物活性试验，证明对机体具有一定生理活性的成分
有效成分/生物活性成分与无效成分/非活性成分之间不能简单机械地划分（可能是相对的、条件依赖的）

2二、天然药物化学发展简史

萌芽期（1940年以前）：研究手段有限，代表药物为纯天然药物，如罂粟。发源于人类文明启蒙期。

形成期（1940年以后）：大量天然产物被挖掘并人工合成，代表如茼蒿，推动学科形成。

快速发展期（20世纪80年代）：组合化学与天然药物化学结合，可在短时间内合成大量结构简单、成药性好的多样性化合物，配合高通量筛选快速、低成本发现先导化合物/候选药物。

升华期（21世纪）：复兴期，致力于揭示生命体进化与调控规律（生命体从无细胞→原核生物→真核单细胞→真菌界/植物界/动物界）。

关键观点

观点："生物碱的研究是天然药物化学发展的开端"

发展的转折点

1930年前后：微量元素分析法导入，试料量降至毫克水平，推进天然成分分析工作
1960年前后：各种层析方法兴起，微量天然新成分分离纯化简便易行；同时红外光谱、核磁共振、质谱等新技术问世，结构研究趋向微量、快捷、正确

3三、天然药物化学与新药发现

（一）从天然产物到天然药物 —— 药物来源分类

缩写	含义
B	生物制品
N	天然产物
ND	天然产物衍生物
S	合成药物
S*	合成天然产物
V	疫苗
NM	类天然产物

统计范围：1981年1月—2019年9月，N=1881 个上市药物。

（二）天然药物是创新药物的源泉

① 结构
天然产物结构类型最多样；经过长期进化与修饰

② 有效性
活性最多样；与蛋白质3D结构匹配度高

③ 安全性
生物相容性好；机体长期适应

（三）天然药物发现故事（5个经典案例）

1. 阿司匹林（柳树/柳皮）

西方：公元前2000多年古埃及《埃伯斯纸草文稿》记录干柳叶有止痛功效。
中国：《神农本草经》记载柳之根皮枝叶可入药，祛痰明目、清热解毒；《本草纲目》记载柳叶煎服可疗心腹内血、止痛、治疥疮，柳枝根皮煮酒可漱齿痛。
说明天然药用经验是阿司匹林发现的源头。

2-3. 青蒿素

青蒿素（artemisinin）是我国科学家20世纪70年代从中药青蒿的原植物黄花蒿（Artemisia annua）中获得的新型含过氧基团的倍半萜内酯，过氧键是其抗疟活性的必须基团。
为提高药效、改善溶解性，对其进行结构修饰：青蒿素用 NaBH4还原得到二氢青蒿素（过氧键不受影响），以此为原料半合成衍生物，主要三类：醚类、酯类、碳酸酯类；其中 蒿甲醚（artemether）和青蒿琥酯（artesunate）发展成抗疟新药。

3. 山羊豆碱与二甲双胍

山羊豆碱（1918年发现，来自山羊豆） → 各种胍类化合物具有相似结构 → 二甲双胍：20世纪50年代上市；70年代末因其他双胍类毒性问题部分退市；1997年FDA批准上市；目前研究证明有抗肿瘤、延缓衰老等新作用。

4. 紫杉醇

1963年首次从短叶红豆杉的树皮和木材中分离得到紫杉醇粗提物；粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性；通过X线分析确定该活性成分的化学结构，命名为紫杉醇；后续证明其具有抗肿瘤等多种活性。

5. 吗啡

吗啡是1806年从鸦片中分离得到的一个生物碱，属于强效镇痛剂，具有成瘾性。以吗啡为模板，合成了许多镇痛药物（来源植物：罂粟）。

4四、新药创新

（一）天然药物结构改造意义

从天然药物和中药中发现具有生物活性的先导化合物，经结构修饰或改造，是目前快速、低廉地创新出高效低毒新药的重要途径。

天然药物常见缺陷需通过化学修饰解决：稳定性差水溶性差毒性大

（二）结构改造实例

1. 青蒿素：见上文衍生物（蒿甲醚、青蒿琥酯）
2. 吗啡：以吗啡为模板合成多种镇痛药
3. 可卡因：天然结构改造为局麻药等
4. Compactin：天然他汀类化合物→改造为临床降脂药（如辛伐他汀等）

（三）天然药物化学对新药创新的意义

天然产物结构多样性使其可参与生命过程多环节的调节，是发现药物先导结构的重要源泉；与合成化合物/组合化学库相比，天然产物在结构骨架和立体化学方面更富有多样性，且分子量、脂水分配系数范围更宽，这些特点与已上市药物非常相似。

第二节　天然化合物的生物合成

初生/次生代谢 · 构建单元 · 组装反应机制 · 五大生物合成途径 · 生物合成意义

1一、初生代谢与次生代谢

初生代谢（primary metabolism）
维持植物生命活动必需，几乎存在于所有绿色植物中。
产物（primary metabolites）：糖、蛋白质、脂质、核酸等——植物的营养物质，人类赖以生存的物质基础。

次生代谢（secondary metabolism）
非所有植物都发生，对维持生命活动非必需。
产物（secondary metabolites）：以初生代谢产物为原料/前体，进一步代谢生成生物碱、萜类等——维持植物特性特征，是重要药物资源。

次生代谢产物分类（重要框架）

按是否成苷分为：苷类和 非苷类。
非苷类按酸碱性（H+/OH-）：挥发油、酸性物质、碱性物质、中性物质。
典型分类包括：脂肪族、芳香酚类、油脂、芳香族、生物碱（N族）、甾族、萜类（单萜/倍半萜/二萜/二倍半萜/三萜/多萜）、苯丙素类、黄酮类、醌类、鞣质、植物甾醇、强心苷、皂苷等。

2二、生物合成的基本构建单元

构建单元	来源 / 说明
C1	最简单结构单位，1个碳，通常以甲基形式存在，常连在O、N或C上
C2	多由乙酰辅酶A提供；聚合前转化为反应活性更高的丙二酸单酰辅酶A
C5	异戊二烯单位，来源于甲戊二羟酸（MVA）或去氧木酮糖磷酸酯（DXP）代谢产物
C6C3	苯丙素结构单元，多由 L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸转化而来（莽草酸途径中的芳香族氨基酸）；消去1个碳→C6C2；消去2个碳→C6C1
C4N	杂环吡咯烷结构，来源于非蛋白氨基酸 L-鸟氨酸
C5N	以 L-赖氨酸为前体，保留ε-氨基氮，构成哌啶环
C6C2N	前体也是L-苯丙氨酸/L-酪氨酸（以酪氨酸为主），一个羧基碳被消去
吲哚C2N	来自 L-色氨酸（含吲哚环），经历类似苯丙氨酸/酪氨酸的脱羧过程

⚠️ 易混点：C5单元来源 MVA/DXP（萜类）；C6C3 来源苯丙氨酸/酪氨酸（莽草酸途径）；C4N/C5N来源鸟氨酸/赖氨酸（氨基酸途径，生物碱）。

3三、天然化合物生物合成组装机制（重要反应类型）

烃化反应：亲核取代 / 亲电加成

Wagner-Meerwein 重排

羟醛缩合 / 克莱森（Claisen）缩合：常有辅酶A的酯参与（如乙酰辅酶A），在ATP和生物素作用下与CO2羧化生成丙二酸单酰辅酶A

席夫碱形成 + 曼尼希反应：胺与醛/酮缩合形成C=N键，脱水生成亚胺/席夫碱（亲电加成）；亚胺质子化形成亚胺正离子可发生曼尼希反应

转氨基反应

脱羧反应

氧化还原反应

酚氧化偶联反应：过氧化物酶/漆酶催化酚产生自由基后偶联；细胞色素P450依赖酶也可催化（NADPH+O2参与，但不转移氧到底物）。应用于木质素、色素、甲状腺激素、抗生素、生物碱合成。例：漆酶介导黄酮木脂素类水飞蓟宾的二聚化

糖基化反应

Diels-Alder（D-A）反应：共轭双烯（二烯体）与取代烯烃（亲双烯体）发生 [4+2]环加成，是构建C-C键最常用方法之一。例：桑树中D-A型天然产物

4四、五大生物合成途径（核心考点）

① 乙酸-丙二酸途径（AA-MA途径）

饱和/不饱和脂肪酸及聚酮类化合物均由此途径合成。
1. 脂肪酸类：乙酰辅酶A（starter）+ 丙二酸单酰辅酶A（extender）经缩合、还原 → 偶数/奇数碳饱和脂肪酸。
2. 聚酮类：两分子乙酰辅酶A经Claisen缩合形成乙酰乙酰辅酶A，反复进行生成多聚-β-酮酸酯链。
3. 酚及其芳聚酮类：多聚-β-酮酸酯可进行分子内Claisen或Aldol反应（如C1-C6、C2-C7、C1-C4、C3-C7环化方式）；由聚酮合成芳香族化合物涉及羟醛缩合、Claisen缩合、羟基化、酚氧化偶联、芳环氧化开环等。

② 甲戊二羟酸途径（MVA）与脱氧木酮糖磷酸酯途径（DXP）—— 萜类/甾类

萜类化合物由异戊二烯单位头-尾相接而成。Wallach（1887）：萜类衍生自异戊二烯的多聚体/衍生物；但部分萜类不能简单分为异戊二烯单元。
真正活性的异戊二烯单位是 IPP（焦磷酸异戊烯酯） 和 DMAPP（焦磷酸二甲基烯丙酯），均来自MVA。
发展史：Ruzicka提出萜类衍生自MVA途径 → Lynen证实IPP在植物中存在 → Folkers (1956) 证明 3R-甲戊二羟酸是IPP的关键前体。
动物 vs 植物：动物中 MVA是唯一途径；植物中大部分萜类由DXP途径产生，三萜和甾类（胞液产物）由MVA途径合成；MVA相关酶在胞液中，DXP相关酶在叶绿体内。
萜类分级：半萜(C10，挥发油)、单萜(C10，挥发油)、倍半萜(C15，如青蒿素)、二萜(C20)、二倍半萜(C25，如蛇孢菌素A)、三萜(C30)、四萜(C40)。

③ 莽草酸途径（shikimic acid pathway）—— 芳香族化合物

合成芳香氨基酸类、苯甲酸类(C6-C1)、桂皮酸类(C6-C3)；进一步可转化为木脂素类、苯丙素类、香豆素类(均C6-C3单位)。
路径概览：糖酵解/磷酸戊糖途径 → 4-磷酸赤藓糖(E4P) + 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) → 莽草酸 → 分支酸（chorismate，关键枢纽） → 分支为(1)色氨酸方向 (2)予苯酸/arogenic acid → 苯丙氨酸、酪氨酸方向。
关键：莽草酸途径哺乳动物中不存在，3种芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）只能由植物和微生物合成，人类需从食物获取。
1. 芳香氨基酸和简单苯甲酸类：莽草酸可转化为苯甲酸类化合物。
2. 桂皮酸途径：C6-C3骨架(苯丙素类、木脂素类)以及C6-C3-C6骨架(黄酮类)均由苯丙氨酸经苯丙氨酸脱氨酶(PAL)脱氨生成的桂皮酸而来；下游经4CL、CHS、CHI等酶生成查尔酮→黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、花色素苷、香豆素类、木质素类等。

④ 氨基酸途径（amino acid pathway）—— 生物碱

氨基酸脱羧成胺类，再经甲基化、氧化、还原、重排等转变为生物碱。
氨基酸碳架来源：柠檬酸循环（α-酮戊二酸→谷氨酸族；草酰乙酸→天冬氨酸族，含赖氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸）；糖酵解（甘油酸-3-磷酸→丝氨酸族；丙酮酸→丙酮酸族，含丙氨酸/缬氨酸/亮氨酸）；磷酸烯醇式丙酮酸+戊糖磷酸途径中间体→芳香族（苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸）及组氨酸。
关键前体→生物碱类型：

鸟氨酸 → 吡咯烷生物碱、吡咯里西啶生物碱、托品烷生物碱（例：颠茄）
赖氨酸 → 哌啶生物碱、吲哚里西啶生物碱、喹诺里西啶生物碱（例：垂盆草）
邻氨基苯甲酸 → 喹啉生物碱、吖啶酮生物碱
苯丙氨酸/酪氨酸 → 简单苯丙胺生物碱、四氢异喹啉生物碱、苄基四氢异喹啉生物碱、苄基苯乙胺生物碱、吐根碱生物碱
色氨酸 → 吲哚类生物碱

代表实例：罂粟 → 可待因（苄基四氢异喹啉生物碱）的生物合成；长春花 → 长春碱（双吲哚类生物碱）的生物合成。

⑤ 复合途径

由两种或以上途径联合形成天然产物，常见组合：①甲戊二羟酸+乙酸-丙二酸 ②乙酸-丙二酸+莽草酸 ③氨基酸+甲戊二羟酸 ④氨基酸+乙酸-丙二酸 ⑤氨基酸+莽草酸。
代表实例：大麻二酚酸的生物合成（萜类+聚酮）；查尔酮和二氢黄酮类化合物的生物合成（莽草酸+乙酸-丙二酸）；喜树 → 喜树碱生物合成途径（萜类+生物碱）。

5五、天然产物生物合成研究的意义

① 有利于天然化合物的结构分类

② 有利于天然化合物的结构推测

③ 指导植物化学分类学

④ 基于生物亲缘关系寻找新药源，定向寻找生物活性成分

⑤ 生物调控，提高活性成分含量

⑥ 指导仿生合成

第三节　天然药物有效成分的提取分离方法

提取方法（溶剂法及特殊方法） · 分离与精制（五大依据）

0前期工作 & 提取分离一般原则

原植物的采集和鉴定

原植物的拉丁学名
采集地点、时间和方法
药用部位
存留样本

了解前人的应用和研究

民间药用情况
以前是否做过研究
研究的深度和广度
已有的实验方案和方法

流程：化学成分 → 提取 → 混合物 → 分离 → 单一化合物 → 结构鉴定
策略：已知成分/已知结构类型 → 参照文献方法、工业方法；未知成分/有效部位 → 活性追踪（定向分离）

1一、天然药物有效成分的提取

（一）溶剂提取法（最常用）

原理：相似相溶；应用于所有化学成分。选择溶剂的考虑因素：尽可能多溶出有效成分而少溶杂质；按"相似相溶"原则匹配有效成分/杂质/溶剂极性；一般不与化学成分起反应（生物碱、有机酸除外）；溶剂的安全、价廉易得、回收方便。

常用有机溶剂的极性顺序（重要记忆）

石油醚 < 苯 < 二氯甲烷 < 乙醚 < 三氯甲烷 < 乙酸乙酯 < 丙酮 < 乙醇 < 甲醇 < 乙腈 < 水
介电常数：小→大；极性：小→大；亲脂性：强→弱；亲水性：弱→强。

常用有机溶剂特点速记

比水重的有机溶剂：三氯甲烷（氯仿）、二氯甲烷
与水分层的有机溶剂：环己烷～正丁醇
与水任意比混溶：丙酮、乙醇、甲醇
介电常数最小：环己烷
从水中萃取苷类/水溶性生物碱常用：正丁醇
溶解范围最广：乙醇

影响溶剂提取效率的因素

溶剂种类
提取方法（回流、渗滤、超声等）
药材粉碎度（粒小者易提取）
溶剂用量（药材量的8/12/16倍等）
提取温度（温度高溶解量大）
提取时间（时间长易达饱和）
提取次数（2、3或4次）

常用溶剂提取分离方法（冷提/热提对比）

方法	溶剂	方式	适用范围	优点	缺点
(1) 浸渍法	水/乙醇	冷提	热不稳定成分	常温/低温即可	出膏率低，提取液易变质
(2) 渗漉法	乙醇	冷提	热不稳定成分	提取效率高	溶剂用量大，提取液易变质
(3) 煎煮法	水	热提	热稳定成分	简便	溶剂消耗量大，操作麻烦
(4) 回流提取法	有机溶剂	热提	热稳定成分	提取效率高	时间较长
(5) 连续回流提取法	有机溶剂	热提	热稳定成分	溶剂反复利用	时间较长

（6）超临界流体萃取法（SFE）

物质处于临界温度和临界压力以上时呈单一相态（超临界流体），常用CO2、N2O、SF6、NH3、乙烷、庚烷、二氯二氟甲烷。

特点：不残留有机溶剂、速度快、收率高、流程简单；无易燃易爆危险，无公害；萃取温度低适合热不稳定物质；只需改变压力即可调溶解性；适用挥发性/脂溶性化合物；可加夹带剂改变极性；可循环利用成本低；可与色谱/IR/MS联用

局限：对脂溶性成分溶解力强，对水溶性成分弱；设备造价高；更换产品时清洗困难。
夹带剂作用：①改善/维持选择性 ②提高难挥发溶质溶解度；如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈

应用：生物碱、挥发油、苯丙素、黄酮、有机酸、苷类、萜类、天然色素的萃取。

（7）超声波提取技术

原理：超声波辅助，空化现象；各种溶剂均可，可加热但所需温度低，提取效率高；应用：皂苷类。

（8）微波提取法

原理：微波具有吸收性、穿透性、反射性；极性溶剂（水）吸收微波能后弛豫释放热能，使内部压力增大，成分流出溶解。
优点：缩短提取时间、提高速率、降低提取温度，对不耐热物质好。
应用：香料、调味品、天然色素、中草药、化妆品等。
影响因素：溶剂选择、样品形状粒度、样品量、微波功率。

其他提取方法（升华法、水蒸气蒸馏法、压榨法）

升华法：原理——遇热挥发，遇冷凝固，应用于具有升华性的成分，如游离蒽醌、樟脑、咖啡因
水蒸气蒸馏法：原理——与水蒸气产生共沸点，应用于具有挥发性的成分，如挥发油
压榨法：原理——机械挤压，应用于新鲜药材、种籽植物油

2二、天然药物有效成分的分离与精制

分离依据（共存成分的性质差异）：①溶解度差别 ②分配比不同 ③吸附性差别 ④分子大小差别 ⑤离解程度不同

（一）根据物质溶解度差别进行分离

与溶解度密切相关的因素：调节温度、改变混合溶剂极性、调节pH、加入沉淀试剂（如雷氏铵盐沉淀季铵碱）。

1. 调节温度（结晶/重结晶）

利用温度变化导致溶解度改变来分离。流程：待纯化物A+杂质B、C → 加甲醇热溶、热滤 → 残渣（C，过滤去除）与滤液（A+B）→ 冷置析晶 → 结晶（A）+ 母液（B）。

2. 改变混合溶剂极性（三种方法）

水/醇法：除去水提液中的水溶性杂质（蛋白质、多糖、果胶、黏液质），如制备黄芪多糖时去除水溶性大分子杂质——中药水提液加数倍量浓醇(75%)静置过夜 → 沉淀(水溶性杂质) + 母液(目标成分)
醇/水法：除去醇提液中的水不溶性杂质（油脂、叶绿素等）——中药醇提液加数倍水静置过夜 → 沉淀(脂溶性杂质) + 母液(目标成分)
醇/醚法或醇/丙酮法：纯化皂苷——皂苷醇溶液加数倍乙醚静置 → 沉淀(皂苷) + 母液(脂溶性杂质)

3. 调节pH（核心：酸碱性化合物的解离/游离状态转换）

原理：通过加酸/加碱调节pH，改变酸性/碱性/两性化合物的存在状态（游离型/分子态 ↔ 解离型/离子态），从而改变其在水/有机相中的溶解性而分离。

(1) 酸/碱法（酸提碱沉）：用于生物碱的提取纯化。流程：醇提物浸膏(B,游离型/脂溶) → 稀酸水提取(BH+,解离型/水溶) → 碱化 → 沉淀(B，游离型，析出)
(2) 碱/酸法（碱提酸沉）：用于黄酮、蒽醌等酚性成分、有机酸的提取纯化。流程：药材(HA,游离型) → 碱水提取(A⁻,解离型/水溶) → 酸化 → 沉淀(HA，游离型，析出)
(3) 调节pH至等电点，沉淀蛋白

4. 加沉淀试剂

酸性成分：用 Pb²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺（如 Pb(Ac)₂）沉淀，水悬浮后通H₂S脱铅得母液
碱性成分（生物碱）：苦味酸盐/苦酮酸盐、磷钼酸盐/磷钨酸盐/雷氏铵盐沉淀水溶性生物碱；或强酸化后用乙醚萃取分离

（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离

常用方法：简单液-液萃取、纸色谱（PC）、逆流分溶（CCD）、液滴逆流色谱（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、气液分配色谱（GC/GLC）、液-液分配色谱。

1. 液-液萃取的分离因子

分配比 K = C上相/C下相（同一物质，两相溶剂）
分离因子 β = K_A/K_B（A、B两溶质在同一溶剂系统的分配系数比值，规定 K_A > K_B）
β值与萃取次数关系：β≥100 → 一次简单萃取即可基本分离；100>β≥10 → 需萃取约10~12次；β≤2 → 需100次以上萃取；β≈1（K_A≈K_B）→ 性质极相近，任意次分配也无法分离。

2. 分配比与pH

对酸性物质(A)：pH<3时多以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂；pH>12时以离解形式(A⁻)存在，易分配于水。
对碱性物质(B)：pH<3时多呈离子状态(BH⁺)；pH>12时呈非离子状态(B)。
pH梯度萃取：梯度调节pH，每次改变一种成分的存在状态，依次分离。缺点：手工操作繁琐、溶剂用量大、易乳化。

3. 纸色谱（PC）与β判据

一般 β>50，简单萃取即可解决；β<50 时宜采用逆流分溶法。
PC：固定相为水，流动相为水饱和的有机溶剂；用于检测/制备样品；Rf值计算分离因子 = Rf_a(1-Rf_b) / [Rf_b(1-Rf_a)]，其中Rf_a>Rf_b。

4. 逆流分溶法（CCD）与5. DCCC / HSCCC

CCD：多次连续的液-液萃取；优点——避免手工操作；缺点——溶剂用量大，机械操作易破损漏液乳化。
DCCC（液滴逆流色谱）：流动相呈液滴形式垂直上升或下降通过固定相液柱。
HSCCC（高速逆流色谱）：行星式旋转产生离心力场，固定相保留在蛇形管内，流动相单向低速通过固定相。

6. 液-液分配柱色谱（正相/反相、加压、涡流、离子对HPLC）

固定相涂覆于硅胶等多孔载体装柱，流动相洗脱，物质按分配比不同被洗脱速度不同而分离。

	载体/固定相	流动相	适用范围
正相分配色谱	硅胶、硅藻土、纤维素粉（固定相为水/缓冲液）	三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂	极性大的成分（CHCl3、EtOAc部位）
反相分配色谱	键合硅胶 RP-2/RP-8/RP-18（C2/C8/C18，石蜡油）	甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水等强极性有机溶剂	极性小的成分（丁醇BuOH部位）

RP柱亲脂性强弱：RP-18 > RP-8 > RP-2。
加压液相柱色谱（常用RP-18 ODS）按压力分级：快速色谱(flash, ~2.02×10⁵Pa) < 低压LPLC(<5.05×10⁵Pa) < 中压MPLC(5.05~20.2×10⁵Pa) < 高效HPLC(>20.2×10⁵Pa)。HPLC特点：加压流动相流速快，载体颗粒小、机械强度大、比表面积大，耐压柱材，自动描记分段收集。
涡流色谱：大粒径填料使流动相高流速(7.5cm/s)产生涡流，加快传质，大分子（蛋白质）来不及扩散进填料即被洗出，小分子待测物保留；优点——可在线联用LC/MS、速度快、效率较高、灵敏度选择性好；缺点——杂质多、污染色谱柱。
反相离子对HPLC：ODS柱中甲醇-水/乙腈-水加入0.01~0.03mol/L离子对试剂，使样品离子与反离子形成不带电中性离子对，增大在非极性固定相中的溶解度，改善分离。离子对选择：季铵类（用于强/弱酸、磺酸染料、羧酸等）；叔胺（磺酸盐、羧酸）；烷基磺酸盐（强/弱碱、生物碱、肽等）；高氯酸（有机胺、氨基酸、肽）。应用：生物碱、有机酸、磺胺类药物、抗生素、维生素的分离。

（三）根据物质吸附性差别进行分离

吸附类型	原理	代表吸附剂
物理吸附	分子间力，无选择性，可逆	硅胶、氧化铝、活性炭
化学吸附	化学键，选择性强，有时不可逆	硅胶—生物碱；碱性氧化铝—黄酮/蒽醌/有机酸
半化学吸附	氢键吸附，力量较弱多可逆	聚酰胺

1. 硅胶、氧化铝、活性炭（物理吸附）

吸附原理：范德华力；三要素：吸附剂、溶质、溶剂；原则："相似者易于吸附"。
活性炭（非极性吸附剂）：对非极性成分吸附强；溶剂极性↑则吸附力↓，可被极性弱的溶剂洗脱。
硅胶/氧化铝（极性吸附剂）：对极性物质亲和力强；溶剂极性↑则吸附力↑，需用极性强的溶剂洗脱。
硅胶：多孔性，SiO2组成，含硅醇基，弱酸性，可与水可逆结合；105℃加热30min脱水活化；500℃加热脱水缩合。含水量越少吸附能力越强；含水>17%则无吸附作用，仅作分配层析载体。极性大的溶剂洗脱能力大。应用：TLC、CC。
氧化铝(Al2O3)：由Al(OH)3高温煅烧而成，弱碱性，吸附性强，按含水量分Ⅰ~Ⅵ级。适用生物碱，不适分离蒽醌/黄酮/有机酸等酸性成分。
活性炭应用：结晶/重结晶中脱色脱臭；从大量稀水液中浓缩微量物质（如一叶秋碱的浓缩精制）。

2. 极性及强弱判断

一般物质极性由官能团种类、数目、位置、碳链长短决定。
常用溶剂的介电常数(ε)与极性（从弱到强）：己烷(1.88) < 苯(2.29) < 乙醚(4.47) < 三氯甲烷(5.20) < 乙酸乙酯(6.11) < 乙醇(26.0) < 甲醇(31.2) < 水(81.0)。

3. 吸附柱色谱法（硅胶/氧化铝柱色谱操作要点）

A. 吸附剂用量：试样量的30~60倍，有时100~200倍
B. 装柱：高度/直径比 (h/d) 约(15:1)~(20:1)
C. 上样：干法/湿法上样
D. 洗脱：常用混合溶剂，极性宜逐步增加，跳跃不能太大
E. 洗脱系统选择：参考TLC的 Rf ≈ 0.2~0.3
TLC拖尾：吸附作用过强。硅胶（碱性成分）展开剂加几滴碱（氨/吡啶/二乙胺）；氧化铝（酸性成分）展开剂加几滴酸（乙酸/甲酸）。

4. 聚酰胺吸附色谱法（半化学吸附，氢键）

原理：氢键吸附（半化学吸附）。
影响吸附力因素：①形成氢键基团数目越多，吸附越强 ②若基团易形成分子内氢键，吸附减弱 ③分子芳香化程度越高，吸附力增强。
上样与洗脱：化合物在不同溶剂中的吸附力随溶剂极性增强而增强 → 水中最强，常以水装柱、样品溶于水上样；含水醇中次之；醇中最弱，常用浓度渐高的含水醇梯度洗脱（EtOH-H2O最常用）。
各溶剂洗脱能力（弱→强）：水 < 甲醇 < 乙醇 < 氢氧化钠水溶液 < 甲酰胺 < 二甲基甲酰胺 < 尿素。
应用：醌类、黄酮类等酚性成分的制备分离；脱鞣质处理。

5. 大孔吸附树脂

性质：白色球形颗粒，多孔网状结构，不溶于酸碱有机溶剂。
原理：①吸附原理（范德华力、氢键吸附）②分子筛性原理。
影响吸附因素：①吸附剂表面性质——非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性物质易被极性树脂吸附 ②溶剂性质——物质在溶剂中溶解度大则树脂吸附力小，反之大。
洗脱剂：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。
应用：苷与糖类分离、生物碱精制、多糖/黄酮/三萜类分离。

（四）根据物质分子大小差别进行分离

1. 凝胶滤过法（分子筛/排阻色谱）

原理：半透膜膜孔或凝胶三维网状结构的分子筛作用，按分子量从大到小依次流出而分离。

葡聚糖凝胶（Sephadex G）：葡聚糖+交联剂（环氧氯丙烷）形成分子筛，水中应用，分离水溶性成分
羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）：由Sephadex G-25羟丙基化所得，可在水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中使用，水溶性、脂溶性成分均可分

2. 膜分离技术

膜类型	截留范围	说明/应用
微滤膜	0.1~10μm	截留颗粒物、澄清液体、去除大部分细菌；可作超滤/反渗透前处理
超滤膜	10~100nm	除去病菌、热原、胶体、蛋白质等大分子；用于分离、提纯、浓缩
纳滤膜	1~10nm	分离去除分子量300~1000的小分子物质，浓缩与透析一体
反渗透膜	≤1nm	仅透过小分子溶剂，截留无机盐/金属离子/低分子量分子；用于制备医用水、注射用水、医用透析水

（五）根据物质离解程度不同进行分离 —— 离子交换法

离子交换树脂外观为球形颗粒，不溶于水但可在水中溶胀。

类型	子类型	交换基团
阳离子交换树脂	强酸性	—SO3H
阳离子交换树脂	弱酸性	—COOH，—PO4H
阴离子交换树脂	强碱性	—N⁺(CH3)3·X / —N⁺(CH3)3·OH
阴离子交换树脂	弱碱性	—NH2，—NH，>N

（强酸型阳离子交换树脂结构 = 母核 + 离子交换基团；应用流程见离子交换树脂分离物质流程图）

（六）分子蒸馏

原理：依靠不同物质分子运动自由程的差别进行分离（重分子与轻分子自由程不同）。

特点：操作温度低；蒸馏压强低（真空度高）；受热时间短（轻分子逸出几乎未碰撞即达冷凝面）；分离程度高

应用：蒸馏天然鱼肝油浓缩维生素A、提取天然/合成维生素E及β-胡萝卜素、提取鱼油/米糠油/小麦胚芽油；食品工业中混合油脂分离（如硬脂酸单甘油酯，纯度可达90%~95%以上）。

第四节　结构研究法

纯度测定 · UV/IR/NMR/MS/ORD-CD/单晶XRD · 结构解析程序 · 研究方法进展

1一、化合物的纯度测定

（一）结晶形状、色泽、熔点
每种化合物的结晶有一定形状、色泽、熔点；可通过晶型均匀一致、熔点明确敏锐来初步判定纯度。非结晶物质不具备这些性质，无法据此鉴定。

（二）薄层色谱法（TLC）
硅胶/纸色谱，通常以组成不同的3种溶剂系统展开；样品均为均一斑点（Rf值在0.2~0.8）可认为是单纯化合物。

（三）气相色谱(GC)或高效液相色谱(HPLC)法
GC主要适用于加热条件下能汽化而不分解的物质（如挥发油）；HPLC可用于挥发性及非挥发性物质，具有高速、高效、灵敏、微量、准确的优点，广泛用于纯度检测。

2二、结构研究中的主要谱学方法 — 概览

六大方法：① UV-vis ② IR ③ NMR ④ MS ⑤ ORD/CD ⑥ 单晶X射线衍射

（一）紫外-可见吸收光谱（UV-vis）

分子吸收波长范围 200~800nm
含共轭双键、发色团及共轭体系助色团的分子产生 π→π* 及 n→π* 跃迁
主要用于鉴定结构中共轭体系的有无

UV谱图判读规则

220~800nm 内无UV吸收 → 脂肪烃、脂环烃或简单衍生物（氯化物、醇、醚、羧酸等）
220~250nm 内强吸收（ε≥10000）→ 共轭二烯或α,β-不饱和醛/酮结构
250~290nm 内中等强度吸收，常有精细结构 → 苯环或某些芳杂环
250~350nm 内弱吸收 → 有羰基或共轭羰基
300nm以上高强度吸收 → 结构有较大共轭体系

溶剂效应

溶剂极性增大：π→π* 跃迁吸收峰向长波移动（红移）；n→π* 跃迁吸收峰向短波移动（蓝移）。非极性溶剂中可观察到清晰的精细结构峰。

黄酮类UV特征（重要应用）

黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基(B环)和苯甲酰基(A环)组成的交叉共轭体系，甲醇溶液在200~400nm有2个主要吸收带：
• A环(苯甲酰基)：峰带Ⅱ，220~280nm
• B环(桂皮酰基)：峰带Ⅰ，300~400nm

UV的价值：①共轭体系——对含共轭双键、α,β-不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定重要 ②特定吸收特征→骨架类型判断（如黄酮、香豆素、蒽醌）③加诊断试剂前后谱图规律变化→取代图式推断（如黄酮、黄酮醇）

3（二）红外光谱（IR）法

利用红外光谱对分子进行分析鉴定：一束不同波长红外射线照射分子，特定波长被吸收形成IR吸收光谱；化学键振动在 4000~400 cm⁻¹ 红外光区引起吸收。

波数区域 (cm⁻¹)	归属
4000~2500	X—H（X=C, N, O, S等）伸缩振动区
2500~2000	三键及连烯类双键的伸缩振动区
2000~1500	双键伸缩振动区（红外谱图中很重要的区域）
1500~1300	C—H弯曲振动信息（—CH2—，—CH3）
1300~910	所有单键伸缩振动、分子骨架振动；部分含氢基团弯曲振动；含重原子双键(P=O, P=S)伸缩振动
<910	苯环因取代而产生的吸收(900~650)，是判断苯环取代位置的主要依据

关键峰位记忆：双键伸缩振动区 2000~1500cm⁻¹；羟基伸缩振动区 3650~3610cm⁻¹（O-H自由）；羰基相关 1730~1690cm⁻¹

4（三）核磁共振（NMR）法

随着傅立叶变换波谱仪诞生，除¹H外，¹³C核研究自20世纪70年代中期迅速开展；多核研究包括¹⁵N, ¹⁹F, ³¹P等。二维/三维NMR技术发展后，NMR已成为结构测定的主要谱学方法。

1. 常用氘代溶剂的化学位移值（δH / δC）

溶剂	δH	δC
丙酮-d6	2.05	206.7, 29.9
苯-d6	7.16	128.4
三氯甲烷-d	7.27	77.2
环己烷-d12	1.38	26.4
D2O	4.80	—
二氯甲烷-d2	5.32	54.0
DMSO-d6	2.50	39.5
甲醇-d4	4.87, 3.31	49.2
吡啶-d5	8.74, 7.58, 7.22	150.4, 135.9, 123.9

2. ¹H-NMR — (1)化学位移大致范围

类型	δ (ppm)
—C—CH3	0.8~1.2
—C—CH2—	1~1.5
—C—CH—	1.2~1.8
R-CH/CH（R=-OH,-COCOR,-OR,-NO2,-X，α位）	在基础值上 +2~4 (α-H)，+0.5~1 (β-H)
R-CH/CH（R=-C=O,-C=C,Ar-）	在基础值上 +1~2 (α-H)，+0.5~1 (β-H)
≡CH	2~3
=CH	5~8
芳环及芳杂环	6~9
—CHO	9~10
活泼氢（OH, SH, NH）	不确定，加D2O后信号消失

3. ¹H-NMR — (2)峰面积 / (3)偶合常数(J)

峰面积：氢信号积分面积与分子中总质子数相当；若分子式已知可算出每信号对应的¹H数。但活泼质子（—OH、—NH、—SH，含酚/羧酸活泼质子）在某些溶剂中（或含水）常不出现信号。

偶合常数(J)：磁不等同的1H核在一定距离内发生偶合裂分；低级偶合符合 n+1规律，产生d(二重)、t(三重)、q(四重)、m(多重)峰；高级偶合有dd、dt、td、m等。化学位移差值×仪器兆周数 = 偶合常数J(Hz)，大小取决于间隔键的距离。
间隔键数越少，J绝对值越大，反之越小；通常超过3根单键的偶合可忽略，但π系统(烯丙基、芳环、萘环)中即使超3根键仍可偶合，称远程偶合（如烯丙偶合、W型偶合）。

4. ¹³C-NMR — (1)信号裂分 / (2)化学位移 / (3)影响因素 / (4)DEPT

(1) 信号裂分：¹³C-¹³C同核偶合一般不考虑；¹H对¹³C的异核偶合很突出，裂分数遵循n+1规律：与直接相连¹H对应——CH3为q峰，CH2为t峰，CH为d峰，季C为s峰。

(2) 化学位移值：

基团	δC (ppm)
脂肪碳	<50
连杂原子碳(C-O,C-N,C-S)	50~100
甲氧基碳(-OCH3)	~55
糖端基碳	95~105
芳香碳/烯碳	98~160
连氧芳碳	140~165
C=O	168~220（醛190~205；酮195~220；羧酸170~185；酯/内酯165~180；酰胺/内酰胺165~180）

(3) 影响化学位移的主要因素：

碳的杂化方式：sp3 < sp < sp2
碳核电子云密度↑ → 化学位移减小（向高场移）
共轭效应：不饱和羰基化合物中β碳比α碳处于低场
分子内作用：分子内氢键使C=O化学位移增加
空间位阻γ-效应：大基团使γ-位碳上氢通过空间挤压，电子云偏向碳原子，使碳化学位移向高场移动
其他效应：电场效应、"重原子"效应、同位素效应

(4) DEPT谱：通过改变照射¹H的脉冲宽度或设定不同弛豫时间，使不同类型¹³C信号呈正向或倒置峰。例：β-紫罗兰酮的DEPT谱。

5. 二维核磁共振（2D-NMR）

(1) 同核化学位移相关谱

¹H-¹H COSY：横纵坐标均为¹H-NMR谱；同一¹H核信号在对角线上相交形成对角峰；对角线以外的点叫相关峰；因COSY谱具对称性，解析对角线一侧即可。例：乙酸乙酯的COSY图谱。
NOESY（nuclear Overhauser effect spectroscopy）：两个/组不同类型质子位于相近空间距离时，照射其中一组会使另一组信号强度增强，即NOE效应；NOE强弱与相关质子空间距离有关。例：贝壳杉烷二萜化合物的NOESY图谱。

(2) 异核化学位移相关谱

HMQC / HSQC：均将¹H与直接相连的¹³C关联，横纵坐标为¹H、¹³C化学位移，交叉峰表示¹³C-¹H相关性；HSQC外观与HMQC相同，但氢谱分辨率更高。例：化合物tachioside的HMQC谱。
HMBC：¹H与远程偶合的¹³C核关联（通常2~3键），可获得季碳及因杂原子切断的偶合系统间的结构信息，用于连接分子片段。例：化合物tamarin的HMBC谱。

5（四）质谱法

不同质荷比的离子经质量分析器分开，被检测记录为质谱图（横坐标=质荷比；纵坐标=离子流强度，常标注为相对丰度）。质谱仪组成：进样系统 → 离子源 → 质量分析器 → 检测器 → 显示器。质谱作用：确定分子量、分子式以及分子碎片结构。

2. 电离技术分类

电子轰击电离（EI-MS）
化学电离（CI-MS）
快原子轰击（FAB）
电喷雾（ESI）
基质辅助激光解吸电离（MALDI）
场解吸（FD）
场致电离（FI）

(1) EI-MS / (2) FAB / (3) ESI 重点对比

EI-MS：样品需加热气化、离子化，得分子离子峰M⁺；难气化、易热解成分测不到M⁺（如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白质、核酸等）。

FAB：离子枪发射高能离子与中性粒子碰撞交换电荷形成高速中性粒子，与样品碰撞使其电离；适用难气化、易热解成分；可得分子离子相关峰 [M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+K]⁺；逐个脱去糖基的碎片峰 [M+H-162]⁺、[M+H-162-146]⁺；可确定分子量、确定糖基的链接顺序、得到苷元的碎片。

ESI：强静电场使试样电离；难气化、易热解、大小分子均可得到信号；准分子离子峰 [M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M-H]⁻。

6（五）旋光光谱（ORD）和圆二色谱（CD）

平面偏振光通过手性物质时，使其偏振平面发生旋转——旋光现象。

1. ORD谱的类型

平坦谱线
单纯Cotton效应谱线：分子中既有不对称中心又有紫外发色团时，产生异常旋光光谱，出现峰和谷——Cotton效应谱线。由长波到短波，先峰后谷="正性"Cotton效应；先谷后峰="负性"Cotton效应。例：睾丸素。
复合Cotton效应谱线（如睾酮的旋光光谱）

2. CD谱

由于ORD曲线复杂，CD曲线更简便。同样有正性/负性Cotton效应：呈正峰=正性曲线，呈负峰=负性曲线。

旋光光谱测定意义：①确定构象 ②确定绝对立体构型（如：化合物7与化合物5的旋光光谱完全一样，提示两者构型相同）

3. 八区律（环己酮经验规则）

(1) 八区律规则：羰基化合物在八区中的位置决定Cotton效应正负
(2) 旋光分担规则：旋光贡献具有加和性；距离羰基越远，贡献越小；基团越大，贡献越大

7（六）单晶X射线衍射技术

一种独立的结构分析方法，可独立完成晶体结构分析
有机化合物常含C、H、N、O等，成键原子间键长约 0.08~0.16nm，常用 Mo靶（Kα=0.071073nm） 和 Cu靶（Kα=0.154178nm） X射线波长；Cu靶可用于绝对构型测定
不仅可定量给出分子立体结构参数，还能完成分子相对构型和绝对构型的测定
目前是测定分子量10万以上化合物单晶样品的唯一分析技术

8三、结构解析程序

确定平面结构：①确定分子式，计算不饱和度 ②官能团、基本骨架的确定

立体结构研究：单晶X射线衍射技术 / 旋光光谱(ORD)或圆二色谱(CD)法 / CD激子手性法 / 反应质谱法 / 核磁共振法

9四、结构研究方法进展

（一）质谱成像技术（MSI）
利用质谱中化合物的分子量（分子离子），实现样本表面物质的原位定性、定量分析，并可视化表征待测化合物的空间分布。
流程：样品处理 → 样品离子化与质谱测定 → 质谱数据可视化。
离子化方式：解吸电喷雾离子化（DESI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）等。

（二）冷冻电镜技术（Cryo-EM）
一种重要的结构生物学技术，目前已达原子级分辨率。
过去主要用于测定生物大分子及生物样本精细结构；
现可在混合样品状态下迅速确定小分子化合物的绝对构型（分辨率可达0.1nm）。

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